아명은 기복(基福). 경남 창원군 웅읍(웅천)면 북부리에서 아버지 주현성과 어머니 조재선의 넷째 아들로 출생. 개통학교를 졸업하고 오산학교에 재학 중이던 1915년 11월 세례를 받았으며, 1917년 가을 안갑수와 결혼했다. 1920년 웅천읍교회에 초청된 김익두 목사 사경회에 참석했다가 은혜를 받고 신학을 공부하기로 결심한 뒤 장로회신학교에 입학(1922년), 1925년 12월 목사안수를 받았다. 신학교 2학년이던 1923년 봄 양산읍교회 조사(助事: 지금의 전도사)를 시작으로 부산 초량교회, 마산 문창교회, 평양 산정현교회에서 목회했다. 아내 안갑수와 사별한 뒤 1935년 11월 오정모와 재혼했다.

주기철은 일제 치하에서 네 차례 검속을 당했는데, 그 시작은 1938년 2월 평양 장로회신학교에서 일어난 ‘김일선 기념식수 훼손사건’으로 추정된다. 이후 같은 해 8월 ‘농우회사건’으로 의성 경찰서에 2차 검속되었고, 1939년 10월에는 특별한 혐의 없이 평양 경찰서에 3차 검속되었다. 일제의 신사참배 반대운동자 검거 시기인 1940년 9월 4차 검속되어 수감생활을 하다가, 건강이 악화되어 병감으로 이송한 며칠 뒤인 1944년 4월 21일 47세의 나이로 감옥에서 순교했다. 대한민국 정부는 그의 공로를 인정해 1963년 건국공로훈장(단장)을 추서했으며, 주기철을 파면한 대한예수교장로회 평양노회는 2006년 4월 그의 목사직을 복권하였다.